作者：李光， 张海峰，王军梅， 徐妙生 ，王全红
【摘要】 目的 分析食管鳞状细胞癌 (ESCC) 在13号染色体长臂1213区（13q1213）上的等位基因杂合性丢失（LOH），以期寻找13q1213区上可能存在的与ESCC有关肿瘤抑制基因（TSG）的缺失区域。方法 用8个位于13q1213区的微卫星标志物，对56例ESCC患者进行PCRLOH分析，56例ESCC患者包括34例有上消化道癌家族史，22例无上消化道癌家族史。结果 56例ESCC患者中，48例（86%）显示一个或更多位点LOH；并发现一个LOH高频率区，位于位点D13S267和D13S219 之间，物理距离仅有2.83Mb；在位点D13S1242有上消化道癌家族史组LOH为68%，明显高于无上消化道癌家族史组的18%，(P=0.003); 在位点D13S289有上消化道癌家族史组LOH为82%，明显高于无上消化道癌家族史组的31%(P=0.008),有显著意义。结论 研究提示染色体13q1213的LOH可能在食管癌发生发展中起重要作用，在染色体13q1213区上，可能存在一个或多个与ESCC发生发展有关肿瘤抑制基因（TSG）。
【关键词】 食管鳞状细胞癌 ；杂合性丢失；肿瘤抑制基因
Loss of Heterozygosity on Chromosome 13q1213 in Esophageal Squamous Cell Carcinoma
Key words：Esophageal squamous cell carcinoma;Loss of heterozygosity;Tumor suppression genes
食管癌是中国最常见的恶性肿瘤之一，70年代曾占中国人恶性肿瘤死亡的第2位[1]，现在仍居第4位[2]。而世界上70%的食管癌病例集中在中国，中国北方一些地区食管癌的发病率是世界最高的[3]。根据Knudson[4]抑癌基因失活形式的理论，检测肿瘤细胞染色体上特定DNA多态标记，分析杂合性丢失（Loss of heterozyosity, LOH）已成为目前检测肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene, TSG）失活和发现及定位新的肿瘤抑制基因的重要手段之一。本研究应用聚合酶连反应（PCR）方法分析56例食管鳞状细胞癌13号染色体长臂1213区（13q1213），8个位点微卫星多态标记物的LOH，以期寻找染色体13q1213区上可能存在的与ESCC有关的肿瘤抑制基因TSG的缺丢区域。
1 材料与方法
1.1 标本
56例ESCC标本取自山西省肿瘤医院1995年1月～1996年12月手术切除标本，其中食管上段1例，中段46例，下段9例。术前取10mL患者静脉血，患者年龄37～65岁，平均54.5岁。男性34例，女性22例。34例有上消化道癌家族史，22例无上消化道癌家族史。标本90%乙醇固定，石蜡包埋。
1.2 激光显微切割和DNA提取
患者静脉血DNA提取,用标准DNA抽提方法，2μL作为DNA模板用于PCR反应正常对照。肿瘤细胞显微切割在光镜下进行，具体方法如文献所述[5，6]。激光显微切割仪为（Laser capture microdissection LCM）Pixcell Ⅱ 100 ; Arcturus Engineering, Mountain view, CA） 切割下的细胞立即悬浮于50μL显微切割消化液中；消化液包含0.01M triHCl; 1mM MEDTA,1%Tween20, 0.05mg/mL蛋白酶K，PH8.0，孵化37℃ 48h，混合液95℃ 10min，灭活蛋白酶K，2μL作为DNA模板用于PCR反应。
1.3 LOH分析
1.3.1 微卫星呈多态标记及PCR反应选择染色体物理定位于13q1213上8个位点的微卫星标志：其中，D13S1242，D13S217，D13S289，D13S290，D13S260位于13q12.12;D13S267，D13A220，D13S219，位于13q12.313.1,进行LOH分析。微卫星引物购自美国Reserch Genetric公司。在10μL PCR反应体系中加入基因组DNA（肿瘤或静脉血）2μL（约含DNA100ng），1μL 10×PCR缓冲液，dNTP200 μmol/L，一对引物各2μmol/L，gold Ampli Taq DNA 聚合酶0.25u，1μci [α32P]dCTP, 加水至10μL后，加入10μL矿物油覆盖反应液，95℃变性10 min。循环条件为：95℃1 min，55℃～60℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环后72℃延伸10 min。
1.3.2 聚丙烯酰凝胶电泳PCR产物用甲酰胺变性示踪液稀释2倍，95℃变性10 min加样4μL于6%变性聚丙烯酰胺凝胶，1 600V电泳1.5～2.5h，将凝胶转至滤纸上，真空干胶，与Kodak Bio Max MR胶片室温37℃ 24h后观察结果。
1.3.3 LOH的判定杂和缺失的判定标准：相对于正常静脉血细胞DNA的一条带密度减少90%以上时可判为丢失。微卫星位点的纯合子病例（即该位点正常体细胞只显示一个基因条带）判为无信息病例。有信息的杂合子病例（该位点正常显示两个条带）分为两种情况，一种为放射自显影显示两个密度相似条带，未保留或未丢失，另一种则为一个条带丢失即等位基因杂合子缺失。
1.4 统计学分析
所有统计学分析采用SAS软件处理。精确t检验及χ2 ，检验P<0.05,统计学上有显著意义。
2 结果
2.1 临床资料56例ESCC，分级：Ⅰ级（分化好）6例；Ⅱ级（中等分化）44例；Ⅲ级（低分化及未分化）6例。淋巴结转移阳性20例，阴性36例。有上消化道家族史与无上消化道家族史病例在年龄、性别、部位、肿瘤分级、淋巴结转移等方面相比统计学上无显著意义，P>0.05。
2.2 LOH: 对8个位点LOH分析，56例ESCC中，48例（86%）存在至少一个位点的LOH 。LOH频率为46%～83%。位点D13S267 LOH最高为83%。我们发现一个区域有非常高的LOH（LOH≥70%），定位于位点D13S267，D13S220和D13S219（LOH率分别为83%、71%和70%）。物理定位距离仅为2.83Mb。有上消化道癌家族史与无上消化道家族史LOH相比，在位点D13S1242有上消化道癌家族史组LOH为68%，明显高于无上消化道癌家族史组的18%(P=0.003); 在位点D13S289有上消化道癌家族史组LOH为82%，明显高于无上消化道癌家族史组的31%(P=0.008),有显著意义。肿瘤部位、分级及淋巴结转移与这些位点的LOH无显著相关性（P>0.05），见表1、图1。
3 讨论
食管癌是最常见的恶性肿瘤之一，5年生存率低于10%。食管癌的发生有明显的地区差异性。作为世界上食管癌发生最高地区之一的山西省，研究表明，发生在这个区域的食管癌有很强的家族聚集性[7]。提示遗传易感因素可能对这特殊人群食管表1 食管鳞状细胞癌染色体13q1213 杂合性丢失B为静脉血； t为鳞癌细胞；← 指示等位缺失带型1a显示在D13S267位点上，例057中t和例081中t均发生LOH,例066中B、t均未发生LOH；1b显示在D13S260位点上，例138中t发生LOH
